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酶标记抗体的制备方法检测分析

更新时间:2024-06-03   点击次数:29次

ELISA试剂盒酶标记抗体的制备

酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

  (1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。在两步法中,先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低。

(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其*比例为:酶/抗体=1-2/1。此法简便有效,一般认为是HRPzui可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中zui后的酶活性测定,因经过*洗涤,游离酶可被除去,并不影响zui终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法zui为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得*的分离效果,但费用较贵。

  结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。zui适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的*灵敏度,达到zui合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的zui高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的zui适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的zui大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。