线粒体呼吸链复合物 I 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

YIJI 线粒体呼吸链复合物 I 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
YIJI 线粒体呼吸链复合物 I（NADH－辅酶 Q 还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成
辅酶 Q 同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧
化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心
研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样
品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶 Q 还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、
蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性
能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶
（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中
zui大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶
（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；
ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的*步。基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情
况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷
酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide
adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH
－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：
产品内容
YIJI 缓冲液（Reagent A）
YIJI 反应液（Reagent B）
YIJI 阴性液（Reagent C）
YIJI 底物液（Reagent D）
YIJI 专性液（Reagent E）
产品说明书
毫升
毫升
毫升
微升
微升
1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI 反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触；
YIJI 反应液（Reagent B）和 YIJI 底物液（Reagent D），避免光照，有效保证 6 月
用户自备
比色皿：用于比色分析的容器
1

双波长分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI 反应液（Reagent B）和
YIJI 底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里（注意：检测前溶解线粒体；参见注意事项 5）
2． 设定好双波长分光光度仪（温度为 30℃）：波长分别为 340nm 和 380nm，间隔 30 秒，读数 7 次（共 3
分钟），并置零（注意：参见注意事项 11）
二、 背景对照测定
1． 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反应液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5． 加入 xx 微升 YIJI 阴性液（Reagent C）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
三、 样品总活性测定
1． 移取 xx 微升 YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反应液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5． 加入 xx 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项 5）
6． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
四、 样品非特异活性测定
1． 移取 xx 微升 YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反应液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI专性液（Reagent E）
4． 加入 xx 微升 YIJI底物液（Reagent D）
5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6． 加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项 5）
2

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
五、 计算样品活性
1）样品活性（总活性或非特异活性）
【（样品读数－背景读数）
单位＝微摩尔 NADH/分钟
＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
2）样品特异活性
样品总活性测定－样品非特异活性测定＝样品特异活性
注意事项
1． 本产品为 21 次（10 个样本）操作，包括背景对照测定
2． 操作时，须戴手套
3． YIJI反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触
4． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
5． 线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至 37℃）循环 3 次或使用 YIJI线粒体溶解
试剂盒－GMS10018
6． 加入样品启动反应后 3 秒内即刻比色测定
7． 通常反应 1 分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续 3 分钟
8． 测定值由高到低变化，即 3 分钟测定读数低于 0 分钟测定读数，表明有酶活性
9． 比色测定后，比色皿须清洗*
10．通常比色测定的 OD340 起始读数 0.5 为理想状态
11．如果用户没有双波长同步测定分光光度仪，可以使用单波长 340nm 替代，注意活性计算时，毫摩尔吸
光系数变成 6.2
12．建议待测样本线粒体蛋白浓度为 10 微克/100 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样
本量；注意计算公式的调整（本公司提供 YIJI线粒体溶解试剂盒 GMS10018 为后续的线粒体蛋
白浓度测定的预处理试剂盒和 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 GMS30030.1）
13．如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为 50 微克/100 微升
14．样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶 Q 还原酶，去除其它干扰因素（例
如复合物 II/III/IV 等）
15．线粒体呼吸链复合物 I（NADH－辅酶 Q 还原酶）单位活性定义为：在 30℃，pH 7.5 条件下，每分钟
内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
16．本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测准确