植物组织中游离氨基酸总量的测定

测定植物体内游离氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。

【原理】

游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。

【仪器设备】

分光光度计；电子天平；容量瓶25ml或50ml 3个；漏斗（直径6厘米）3个、滤纸适量；20ml刻度试管 7支；移液管0.5ml 3支、5ml 1支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜（封试管口）；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅（含铁丝筐）。

【试剂】

    1．3%茚三酮试剂  称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10天。

2．氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：

（1）NaCN贮备液0.01mol/L（490mg/L）。

（2）醋酸缓冲液：称360g醋酸钠（含三分子结晶水）溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。

取溶液（1）20ml，用溶液（2）定容到1L。

3．标准氨基酸  称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或α-丙氨酸8.9mg）溶于10%的异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5μmol，或氨基氮7μg。

4．95%乙醇；5．异丙醇（分析纯）。

【操作步骤】

    1．标准曲线的制作  取20ml刻度试管18支，按下表15-1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100℃水浴中加热12min（加热时封口），取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。

表15-1  各试管加入试剂量

2．样品提取  选取有代表性的植物叶片（或其它组织），洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.10～0.20g（视氨基酸含量多少而定），共称3份，分别加入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞（或系上塑料薄膜），置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，zui后定容至刻度，摇匀。

3．样品测定  另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。

根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度。

4．计算  游离氨基酸含量（NH₂ －Nμg / g FW）＝

式中  C－由直线方程计算的值，即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数（_μmol）；

V－样品提取液经稀释后的总体积（ml）；

W－样品重（g）。

测定结果按表15-2记录。

表15-2 游离氨基酸总量测定记载表      测定日期：